การแช่แข็งตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ ของหนูเม้าส์สายพันธุ์ ICR/Mlac-Hydro และ ICR/Mlac-Free Hydro อย่างยาวนาน ที่ศูนย์สัตว์ทดลองแห่งชาติ มหาวิทยาลัยมหิดล
คำสำคัญ:
หนูเม้าส์ , ตัวอ่อน , การแช่แข็ง , การย้ายฝากตัวอ่อน , ธนาคารตัวอ่อนบทคัดย่อ
วัตถุประสงค์และที่มา : ศูนย์สัตว์ทดลองแห่งชาติ มหาวิทยาลัยมหิดล เป็นแหล่งเพาะขยายพันธุ์สัตว์ทดลองสำหรับใช้ในงานวิจัยของประเทศไทยและได้ปรับปรุงพันธุ์หนูเม้าส์สายพันธุ์ ICR/Mlac-hydro และ ICR/Mlac-free hydro เพื่อใช้เป็นสัตว์ทดลองต้นแบบของภาวะไตบวมน้ำในมนุษย์ พร้อมทั้งได้เก็บรักษาสายพันธุ์ไว้ในธนาคารตัวอ่อนตั้งแต่พุทธศักราช 2557 เพื่อป้องกันการสูญเสียสายพันธุ์สัตว์ทดลอง สร้างความมั่นคงทางด้านสายพันธุ์สัตว์ทดลอง เพิ่มความหลากหลายของสายพันธุ์สัตว์ทดลอง สนับสนุนการพัฒนาทางด้านวิทยาศาสตร์สัตว์ทดลอง ลดการนำเข้าสัตว์ทดลองที่มีราคาแพงและลดต้นทุนการเลี้ยงสัตว์ทดลอง เป็นต้น อย่างไรก็ตามหนูเม้าส์สายพันธุ์นี้ได้ยุติการเพาะขยายพันธุ์ลง เพื่อให้มั่นใจว่าจะสามารถจัดตั้งโคโลนีหนูเม้าส์สายพันธุ์นี้ได้อีกครั้ง ตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ที่เก็บรักษาไว้ในธนาคารตัวอ่อนเป็นเวลา 11 ปี จะถูกนำออกมาอุ่นละลายเพื่อศึกษาร้อยละของการรอดชีวิต ตัวอ่อนที่รอดชีวิตจะถูกนำมาย้ายฝากตัวอ่อนเพื่อศึกษาร้อยละของลูกแรกคลอดและลูกหนูเม้าส์จะถูกทดสอบความสมบูรณ์พันธุ์ด้วยการผสมพันธุ์ตามธรรมชาติ
วิธีดำเนินการวิจัย : การศึกษานี้ได้รับการอนุมัติการใช้สัตว์ทดลองในงานวิจัยจากคณะกรรมการกำกับดูแลการดำเนินการต่อสัตว์เพื่องานทางวิทยาศาสตร์ของศูนย์สัตว์ทดลองแห่งชาติ มหาวิทยาลัยมหิดล (รหัสโครงการ AP2024-02) และดูแลสัตว์ทดลองตามมาตรฐานของ Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) International หนูเม้าส์ทั้งหมดอยู่ในห้องเลี้ยงสัตว์ทดลองที่มีสภาพแวดล้อมแบบระบบอนามัยเข้ม ควบคุมอุณหภูมิ 22±3 องศาเซลเซียส ความชื้นสัมพัทธ์ 30-70 เปอร์เซ็นต์ ให้แสงสว่าง 14 ชั่วโมง มืด 8 ชั่วโมง เปิดไฟเวลา 6.00 นาฬิกา ปิดไฟเวลา 20.00 นาฬิกา กินน้ำดื่มชนิด reverse osmosis ที่ผสมคลอรีนให้มีความเข้มข้น 5-7 ppm และอาหารสำเร็จรูป ให้อาหารและน้ำดื่มวันละครั้ง หนูเม้าส์เข้าถึงอาหารและน้ำดื่มได้ตลอดเวลา ใช้วัสดุรองนอนปลอดเชื้อเป็นซังข้าวโพด ผักตบชวาอบแห้งแบบท่อนและผักตบชวาอบแห้งแบบเส้น ก่อนการอุ่นละลายจะเตรียมเพลทเลี้ยงตัวอ่อนด้วย M16 medium บนจานเลี้ยงเซลล์ขนาด 35 มิลลิเมตร ประกอบด้วย wash drop ปริมาณ 50 ไมโครลิตร 3 drop และ culture drop ปริมาณ 150 ไมโครลิตร คลุมเพลทด้วย mineral oil และบ่มข้ามคืนใน CO2 incubator เช้าวันต่อมา นำหลอดแช่แข็งออกจากถังไนโตรเจนเหลว ละลายที่อุณหภูมิห้อง 20 วินาที ละลายในน้ำอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส 20 วินาที ตัดปลายหลอดแช่แข็งทั้ง 2 ข้าง ปล่อยให้ตัวอ่อนที่แขวนลอยอยู่ในน้ำยาแช่แข็งและ 0.3 M Trehalose ไหลลงในจานเลี้ยงเซลล์ อีก 30 วินาที ต่อมา ค้นหาตัวอ่อนภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ใช้ mouse pipette ดูดตัวอ่อนไปแช่ใน 0.3 M Trehalose ปริมาณ 50 ไมโครลิตร 3 นาที ย้ายตัวอ่อนไปแช่ใน 0.15 M Trehalose ปริมาณ 50 ไมโครลิตร 3 นาที ย้ายตัวอ่อนไปแช่ใน 0.075 M Trehalose ปริมาณ 50 ไมโครลิตร 3 นาที และแช่ใน Holding medium ปริมาณ 50 ไมโครลิตร 5 นาที ล้างตัวอ่อนใน M2 medium ปริมาณ 50 ไมโครลิตร 3 ครั้ง ล้างตัวอ่อนใน wash drop 3 ครั้ง คัดเลือกตัวอ่อนที่รอดชีวิตไปไว้ใน culture drop และบ่มใน CO2 incubator จากนั้นย้ายฝากตัวอ่อนที่รอดชีวิตเข้าสู่ท่อนำไข่ของแม่ตัวรับ ติดตามการคลอดลูกในวันที่ 19-20 หลังย้ายฝากตัวอ่อนและลูกหนูเม้าส์สายพันธุ์ละ 1 คู่จะถูกจับคู่ผสมพันธุ์ที่อายุ 7 สัปดาห์
ผลการวิจัย : จากการอุ่นละลายตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ของหนูเม้าส์สายพันธุ์ ICR/Mlac-hydro จำนวน 157 ตัวอ่อน สามารถค้นพบตัวอ่อนทั้งหมด 142 ตัวอ่อน มีตัวอ่อนสูญหาย 15 ตัวอ่อน มีตัวอ่อนตาย 48 ตัวอ่อน เหลือตัวอ่อนรอดชีวิตจำนวน 94 ตัวอ่อน คำนวณร้อยละของการรอดชีวิตได้ 59.9 (94/157) สำหรับหนูเม้าส์สายพันธุ์ ICR/Mlac-free hydro จำนวน 208 ตัวอ่อน สามารถค้นพบตัวอ่อนทั้งหมด 196 ตัวอ่อน มีตัวอ่อนสูญหาย 12 ตัวอ่อน มีตัวอ่อนตาย 88 ตัวอ่อน เหลือตัวอ่อนรอดชีวิตจำนวน 108 ตัวอ่อน คำนวณร้อยละของการรอดชีวิตได้ 51.9 (108/208) อีกทั้งร้อยละของการรอดชีวิตของตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ของหนูเม้าส์ทั้ง 2 สายพันธุ์ ไม่มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (Fisher’s Exact Test, P>0.05) หลังจากการย้ายฝากตัวอ่อนที่รอดชีวิตจำนวน 94 ตัวอ่อนของหนูเม้าส์สายพันธุ์ ICR/Mlac-hydro ให้แม่ตัวรับจำนวน 8 ตัว พบว่าแม่ตัวรับหมายเลข 3, 4, 6 และ 8 คลอดลูกจำนวน 7, 8, 9 และ 8 ตัว ตามลำดับ คำนวณร้อยละของลูกแรกคลอดได้ 30.9 (29/94) แบ่งออกเป็นลูกเพศผู้ 19 ตัว และลูกเพศเมีย 10 ตัว ส่วนการย้ายฝากตัวอ่อนที่รอดชีวิตจำนวน 108 ตัวอ่อนของหนูเม้าส์สายพันธุ์ ICR/Mlac-free hydro ให้แม่ตัวรับจำนวน 7 ตัว พบว่าแม่ตัวรับหมายเลข 10 และ 13 คลอดลูกจำนวน 7 และ 4 ตัว ตามลำดับ คำนวณร้อยละของลูกแรกคลอดได้ 10.2 (11/108) แบ่งออกเป็นลูกเพศผู้ 7 ตัว และลูกเพศเมีย 4 ตัว อย่างไรก็ตามร้อยละของลูกแรกคลอดของหนูเม้าส์ทั้ง 2 สายพันธุ์ มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (Fisher’s Exact Test, P<0.05) จากการจับคู่ผสมพันธุ์หนูเม้าส์สายพันธุ์ละ 1 คู่ พบว่าหนูเม้าส์สายพันธุ์ ICR/Mlac-hydro คลอดลูกจำนวน 6 ตัว แบ่งออกเป็นหนูเพศผู้ 3 ตัว และหนูเพศเมีย 3 ตัว สำหรับหนูเม้าส์สายพันธุ์ ICR/Mlac-free hydro คลอดลูกจำนวน 7 ตัว แบ่งออกเป็นหนูเพศผู้ 3 ตัว และหนูเพศเมีย 4 ตัว
สรุปผลการวิจัย : หนูเม้าส์สายพันธุ์ ICR/Mlac-hydro และ ICR/Mlac-free hydro สามารถเก็บรักษาสายพันธุ์ไว้ในธนาคารตัวอ่อนได้ ตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ที่ถูกแช่แข็งเก็บไว้เป็นระยะเวลา 11 ปี สามารถรอดชีวิตหลังการอุ่นละลายและคลอดออกมาเป็นลูกหนูเม้าส์ที่มีชีวิตหลังการย้ายฝากตัวอ่อนได้ อีกทั้งลูกหนูเม้าส์สามารถผสมพันธุ์ตามธรรมชาติและมีจำนวนเพียงพอสำหรับจัดตั้งโคโลนีสัตว์ทดลองได้อีกครั้ง
เอกสารอ้างอิง
Eum, J. H., Park, J. K., Lee, W. S., Cha, K. R. Yoon, T. K., & Lee, D. R. (2009). Long-term liquid nitrogen vapor storage of mouse embryos cryopreserved using vitrification or slow cooling. Fertility and Sterility, 91(5), 1928-1932.
Ghandy, N., & Karimpur Malekshah, A. A. (2017). Which stage of mouse embryos is more appropriate for vitrification?. International Journal of Fertility and Sterility, 10(4), 357-362.
Isarangkul, D., Wiyakrutta, S., Kengkoom, K., Reamtong, O., & Ampawong, S. (2015). Mitochondrial and cytoskeletal alterations are involved in the pathogenesis of hydronephrosis in ICR/Mlac-hydro mice. International Journal of Clinical and Experimental Medicine, 8(6), 9192-9204.
Kengkoom, K., Zaw, K. M., Inpunkaew, R., Angkhasirisap, W., Thongsiri, P., & Ampawong, S. (2012).
Development of hydronephrosis inbred strain mouse, ICR/Mlac-Hydro. Journal of Animal and Veterinary Advances, 11(12), 2054-2058.
Nematollahi Mahani, S., Rezazadeh, M., & Emami Meibodi, M. (1999). Preimplantation mouse embryo cryopreservation with propandiol and sucrose: The effect of developmental stage. Cell Journal (Yakhteh), 1(2), 15-20.
Park, M. C., Kim, J. Y., Kim, S. B., Park, Y. S., Park, H. D., Lee, J. H., Oh, D. S., & Kim, J. M. (2009). The effect of cryopreservation on the mouse embryos at various-pronuclear stages. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 22(2), 174-180.
Rall, W. F., Schmidt, P. M., Lin, X., Brown, S. S., Ward, A. C., & Hansen, C. T. (2000). Factors affecting the efficiency of embryo cryopreservation and rederivation of rat and mouse models. Institute of Laboratory Animal Resources Journal, 41(4), 221–227.
Sa-ardrit, M., Faisaikarm, T., Boonkusol, D., Pratipnatalang, N., Chantip, S., Chariyahpongpun, P., Svasti, S., & Kengkoom, K. (2011). Embryo cryopreservation and transfer of thalassemia transgenic mouse. In Proceedings of 49th Kasetsart University Annual Conference: Sciene. (pp. 258-264). Bangkok: Kasetsart University. (in Thai)
Suntornsaratoon, P., Wongdee, K., Tiyasatkulkovit, W., Ampawong, S., Krishnamra, N., Kengkoom, K., & Charoenphandhu, N. (2014). Defective bone microstructure in hydronephrotic mice: a histomorphometric study in ICR/Mlac-hydro mice. the Anatomical Record, 297, 208-214.
Taketsuru, H., Tsukada, Y. I., & Kaneko, T. (2022). Survivability and subsequent development of vitrified early-stage mouse embryos after warming at different temperatures. Biochemical and Biophysical Research Communicaitons, 591, 50-53.
Takeo, T., Nakao, S., Nakagawa, Y., Sztein, JM., & Nakagata, N. (2020). Cryopreservation of mouse resources. Laboratory Animal Research, 36:33. doi.org/10.1186/s42826-020-00066-w
Thorat, R., & Ingle, A. (2012). An attempt of cryopreservation of mouse embryos at the ACTREC laboratory animal facility in India. Experimental Animals, 61(2), 139-145.
Whittingham, D. G., Leibo, S. P., & Mazur, P. (1972). Survival of mouse embryos frozen to -196 degrees and -269 degrees C. Science (New York, N.Y.), 178(4059), 411–414.
Whittingham, D. G. (1974). Embryo bank in the future of developmental genetics. Genetics, 78, 395-402.
Yan, J., Suzuki, J., Yu, X. M., Qiao, J., Kan, F. W., & Chian, R. C. (2011). Effects of duration of cryo-storage of mouse oocytes on cryo-survival, fertilization and embryonic development following vitrification. Journal of assisted reproduction and genetics, 28(7), 643–649.
ดาวน์โหลด
เผยแพร่แล้ว
รูปแบบการอ้างอิง
ฉบับ
ประเภทบทความ
สัญญาอนุญาต
ลิขสิทธิ์ (c) 2025 คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยบูรพา
อนุญาตภายใต้เงื่อนไข Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
Burapha Science Journal is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International (CC BY-NC-ND 4.0) licence, unless otherwise stated. Please read our Policies page for more information
