การศึกษาการย้ายฝากตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ ในหนูแรทสายพันธุ์ Mlac:WR
คำสำคัญ:
หนูแรท, ตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ , การแช่แข็ง, การย้ายฝากตัวอ่อน, ธนาคารตัวอ่อนบทคัดย่อ
วัตถุประสงค์และที่มา : ศูนย์สัตว์ทดลองแห่งชาติ มหาวิทยาลัยมหิดล มุ่งหวังที่จะเก็บรักษาสายพันธุ์หนูแรท Wistar (Mlac:WR) ไว้ในธนาคารตัวอ่อน เพื่อเป็นแหล่งรวบรวมพันธุกรรมของสัตว์ทดลอง ช่วยป้องกันการสูญเสียสายพันธุ์สัตว์ทดลองจากการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม ความเสื่อมทางระบบสืบพันธุ์ ระบบงานเลี้ยงสัตว์ทดลองล้มเหลว การติดเชื้อภายในโคโลนีของสัตว์ทดลอง การเกิดภัยพิบัติทางธรรมชาติ การยุติการเพาะขยายพันธุ์สัตว์ทดลองบางชนิด และการลดต้นทุนการเลี้ยงสัตว์ทดลอง เป็นต้น นอกจากนั้นการเก็บรักษาสายพันธุ์สัตว์ทดลองไว้ในธนาคารตัวอ่อนยังช่วยป้องกันการขาดแคลนสัตว์ทดลองภายในประเทศและลดการนำเข้าสัตว์ทดลองที่มีราคาแพง ดังนั้น การศึกษานี้จึงจัดทำขึ้นเพื่อผลิตตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ จากหนูแรทสายพันธุ์ Mlac:WR ด้วยวิธีการผลิตตัวอ่อนแบบในร่างกาย (in vivo embryo production) ร่วมกับเทคนิคกระตุ้นเพิ่มจำนวนไข่ตก (superovulation) เพื่อให้ทราบถึงร้อยละของตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ (% 2-cell stage embryos) ตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์จะถูกแช่แข็งด้วยวิธี vitrification จากนั้นอุ่นละลายตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ออกมาศึกษาร้อยละของการรอดชีวิต (% survival) ตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ที่รอดชีวิตหลังการแช่แข็งจะถูกนำไปย้ายฝากให้แม่ตัวรับเพื่อให้ทราบถึงร้อยละของลูกแรกคลอด (% newborn)
วิธีดำเนินการวิจัย : เลี้ยงหนูแรทสายพันธุ์ Mlac:WR ในห้องเลี้ยงสัตว์ทดลองระบบอนามัยเข้ม ควบคุมอุณหภูมิ 22±3 องศาเซลเซียส ความชื้นสัมพันธ์ 30-70 เปอร์เซ็นต์ แสงสว่าง 12 ชั่วโมง (เปิดไฟเวลา 6.00-18.00 นาฬิกา) หนูแรทกินน้ำชนิด reverse osmosis ที่ผสมคลอรีนให้มีความเข้มข้น 5-7 ppm และอาหารสำเร็จรูปแบบเม็ด (ad libitum) สัตว์ทดลองทั้งหมดได้รับการดูแลตามมาตรฐานของ Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) International และการศึกษาครั้งนี้ได้รับอนุมัติการใช้สัตว์ทดลองในงานวิจัยจากคณะกรรมการกำกับดูแลการดำเนินการต่อสัตว์เพื่องานทางวิทยาศาสตร์ของศูนย์สัตว์ทดลองแห่งชาติ มหาวิทยาลัยมหิดล (NLAC-ACUC, รหัสโครงการ RA2023-33) โดยหนูแรทเพศเมียอายุ 9 สัปดาห์ จำนวน 8 ตัว จะถูกกระตุ้นเพิ่มจำนวนไข่ตกด้วยการฉีดฮอร์โมน pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) ปริมาณ 175 IU/kg BW เข้าทางช่องท้องในเวลา 9.00-10.00 นาฬิกา อีก 50 ชั่วโมง ต่อมา ฉีดตามด้วยฮอร์โมน human chorionic gonadotropin (hCG) ปริมาณ 300 IU/kg BW ในเวลา 11.00-12.00 นาฬิกา แล้วจับคู่ผสมพันธุ์กับหนูแรทเพศผู้อายุ 12 สัปดาห์ ข้ามคืน หลังจากฉีด hCG ได้ 46-47 ชั่วโมง การุณยฆาตหนูแรทเพศเมียด้วยก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ ผ่าตัดเก็บท่อนำไข่และชะล้างตัวอ่อนทั้งหมดออกจากท่อนำไข่ด้วย M2 medium ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ตรวจนับและล้างตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ที่มีรูปร่างปกติใน M2 medium 3 ครั้ง พักตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ ใน M16 medium ปริมาณ 150 ไมโครลิตร ที่คลุมด้วย mineral oil ที่เตรียมและบ่มไว้ข้ามคืนในตู้ CO2 incubator (อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์และความชื้น 95 เปอร์เซ็นต์) จากนั้นแช่ตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ใน EFS20 (20% v/v ethylene glycol, 15% w/v Ficoll® PM 70, 0.25 M sucrose) นาน 2 นาที และแช่แข็งตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ด้วยวิธี vitrification ใช้น้ำยาแช่แข็งชนิด EFS40 (40% v/v ethylene glycol, 30% w/v Ficoll® PM 70, 0.5 M sucrose) บรรจุในหลอดแช่แข็ง ชนิด 0.25 ml straw tube เก็บรักษาหลอดแช่แข็งในถังไนโตรเจนเหลวนาน 7 วัน จากนั้นอุ่นละลายตัวอ่อนแช่แข็งด้วยน้ำยาอุ่นละลายชนิด 0.75 M sucrose และ 0.25 M sucrose ตามลำดับ ตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ ที่รอดชีวิตหลังการแช่แข็งจะถูกพักไว้ใน M16 medium เพื่อรอย้ายฝากตัวอ่อน หลังจากนั้นตรวจหาหนูแรทเพศเมียอายุ 8 สัปดาห์ ที่อยู่ในระยะ proestrus ด้วยวิธี vaginal smear นำไปผสมพันธุ์กับหนูแรทเพศผู้ที่ทำหมันแล้วอายุ 12 สัปดาห์ หนูแรทเพศเมียที่มี vaginal plug หรือพบว่าได้รับการผสมพันธุ์จะถูกใช้เป็นแม่ตัวรับ ตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ที่รอดชีวิตหลังการแช่แข็งจะถูกย้ายฝากเข้าไปในท่อนำไข่ของแม่ตัวรับ ติดตามการคลอดลูกในวันที่ 19-20 หลังการย้ายฝากตัวอ่อน
ผลการวิจัย : จากการผลิตตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ ในหนูแรทสายพันธุ์ Mlac:WR อายุ 9 สัปดาห์ ด้วยวิธีการผลิตตัวอ่อนแบบในร่างกายร่วมกับเทคนิคกระตุ้นเพิ่มจำนวนไข่ตกนั้น พบว่าสามารถเก็บตัวอ่อนได้ทั้งหมดจำนวน 202 ตัวอ่อน แบ่งออกเป็นตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ จำนวน 139 ตัวอ่อน (17.4±6.4) ตัวอ่อนระยะ 4 เซลล์ จำนวน 18 ตัวอ่อน (2.3±0.9) และตัวอ่อนที่ผิดปกติ จำนวน 45 ตัวอ่อน (5.6±3.5) คำนวณร้อยละของตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ ได้ 68.8 (139/202) ตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ จำนวน 139 ตัวอ่อน ถูกแช่แข็งด้วยวิธี vitrification จำนวน 3 หลอด หลอดละ 47, 47 และ 45 ตัวอ่อน ตามลำดับ หลังจากอุ่นละลายตัวอ่อนแช่แข็งในหลอดที่ 1 (47 ตัวอ่อน) สามารถค้นพบตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์จำนวน 45 ตัวอ่อน มีตัวอ่อนตายระหว่างการอุ่นละลายจำนวน 13 ตัวอ่อน เหลือตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ที่รอดชีวิตหลังการแช่แข็งจำนวน 32 ตัวอ่อน คำนวณร้อยละของการรอดชีวิตได้ 68.1 (32/47) จากการย้ายฝากตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ที่รอดชีวิตหลังการแช่แข็งให้แม่ตัวรับจำนวน 2 ตัว ตัวละ 16 ตัวอ่อน พบว่าแม่ตัวรับหมายเลข 1 คลอดลูกจำนวน 1 ตัว และแม่ตัวรับหมายเลข 2 คลอดลูกจำนวน 3 ตัว แบ่งออกเป็นลูกเพศเมียจำนวน 1 ตัว และลูกเพศผู้จำนวน 3 ตัว คำนวณร้อยละของลูกแรกคลอดได้ 12.5 (4/32)
สรุปผลการวิจัย : ตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ ของหนูแรทสายพันธุ์ Mlac:WR สามารถใช้สำหรับแช่แข็งตัวอ่อนเพื่อเก็บรักษาสายพันธุ์หนูแรทในธนาคารตัวอ่อนได้ เนื่องจากมีร้อยละของตัวอ่อนระยะ 2 เซลล์ที่ได้จากการผลิตตัวอ่อนแบบในร่างกายและร้อยละของการรอดชีวิตหลังการแช่แข็งอยู่ในระดับค่อนข้างสูง แม้ว่าร้อยละของลูกแรกคลอดจะอยู่ในระดับต่ำ อย่างไรก็ตามการศึกษานี้เป็นการย้ายฝากตัวอ่อนหนูแรทสายพันธุ์ Mlac:WR สำเร็จเป็นครั้งแรกของศูนย์สัตว์ทดลองแห่งชาติ สำหรับความรู้และทักษะที่ได้จากการศึกษาครั้งนี้จะถูกใช้พัฒนาเทคนิคการย้ายฝากตัวอ่อนให้มีประสิทธิภาพสูงขึ้น เพื่อให้จัดตั้งธนาคารตัวอ่อนหนูแรทได้สำเร็จและส่งเสริมให้ศูนย์สัตว์ทดลองแห่งชาติ มหาวิทยาลัยมหิดล เป็นแหล่งเรียนรู้เทคนิคปฏิบัติการด้านธนาคารตัวอ่อนในสัตว์ทดลองของประเทศไทย
References
Aoto, T., Takahashi, R. I., & Ueda, M. (2011). A protocol for rat in vitro fertilization during conventional laboratory working hours. Transgenic research, 20, 1245-1252.
Buaban, T., Sukglin, T., Zaw, K. M., Chomanee, P., Kengkoom, K., & Pratip-Na-Talang, N. (2015). Efficacy in in-vitro culture of rat 1-cell stage embryos by KSOM and mR1ECM medium. In Proceedings of 53rd Kasetsart University Annual Conference: Plants, Animals, Veterinary Medicine, Fisheries, Agricultural Extension and Home Economics. (pp. 875-880). Bangkok: Kasetsart University. (in Thai)
Buaban, T., Chomanee, P., & Pratip-Na-Talang, N. (2016). A comparison of the development of Mlac:WR rat 1-cell stage embryos in M16 and KSOM medium. In Proceedings of 54th Kasetsart University Annual Conference: Plants, Animals, Veterinary Medicine, Fisheries, Agricultural Extension and Home Economics. (pp. 483-489). Bangkok: Kasetsart University. (in Thai)
Chumanee, P., Laosantisuk, A., Thongsiri, P., Likitsuntornwong, W., Butrat, P., & Pinpart, T. (2022). Selecting and establishment of a low-incidence hydronephrosis wistar rat (Mlac:WR) colony at the National Laboratory Animal Center, Mahidol university, Thailand. Journal of Professional Routine to Research, 9(1), 39-44.
Eto, T., Takahashi, R., Kamisako, T., Hioki, L., & Sotomaru, Y. (2014). A study on cryoprotectant solution suitable for vitrification of rat two-cell stage embryos. Cryobiology, 68, 147-151.
Han, M. S., Niwa, K., & Kasai, M. (2003). Vitrification of rat embryos at various developmental stages. Theriogenology, 59, 1851-1863.
Hino, C., Ueda, J., Funakoshi, H., & Matsumoto, S. (2020). Defined oocyte collection time is critical for reproducible in vitro fertilization in rats of different strains. Theriogenology, 144, 146-151.
Jiang, J. Y., Umesu, M., & Sato, E. (1999). Vitrification of two-cell rat embryos derived from immature hypothyroid rdw rats by in vitro fertilization in ethylene glycol-based solutions. Cryobiology, 38, 160-164.
Kito, S., Yano, H., Ohta, Y., & Tsukamoto, S. (2010). Superovulatory response, oocyte spontaneous activation, and embryo development in WMN/Nrs inbred rats. Experimental Animals, 59(1), 35-45.
Kon, H., Tohei, A., Hokao, R., & Shinoda, M. (2005). Estrous cycle stage-independent treatment of PMSG and hCG can induce superovulation in adult wistar-imamichi rats. Experimental Animals. 54(2), 185-187.
Polisseni, A. F., Andrade, A. T. L., Ribeiro, L. C., Castro, I. Q., Brandão, M., Polisseni, F., & de Oliveira Guerra, M. (2013). Effects of a continuous-combined regimen of low-dose hormone therapy (oestradiol and norethindrone acetate) and tibolone on the quality of life in symptomatic postmenopausal women: a double-blind, randomized study. Maturitas, 74(2), 172-178.
Popova, E., Bader, M., & Krivokharchenko, A. (2005). Strain differences in superovulatory response, embryo development and efficiency of transgenic rat production. Transgenic Research, 14, 729-738.
Srimangkornkaew, P., Suwannasaroj, K., Yottharat, P., & Sirimontaporn, A. (2021). Historical control data from repeated dose 90-days oral toxicity studies of wistar rats (Mlac:WR). Bulletin of the Department of Medical Sciences, 63(3), 595-606.
Sotomaru, Y., Kamisako, T., & Hioki, K. (2005). Estrous stage- and animal age-independent superovulation in the BrlHan:WIST@Jcl(GALAS) rat. Experimental Animals, 54(2), 137-141.
Taketsuru, H., & Kaneko, T. (2013). Efficient collection and cryopreservation of embryos in F344 strain inbred rats. Cryobiology, 67(2), 230-234.
Taketsuru, H., & Kaneko, T. (2018). Tolerance to vitrification of rat embryos at various developmental stages. Cryobiology, 84, 1-3.
Downloads
เผยแพร่แล้ว
How to Cite
ฉบับ
บท
License
Copyright (c) 2025 คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยบูรพา
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
Burapha Science Journal is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International (CC BY-NC-ND 4.0) licence, unless otherwise stated. Please read our Policies page for more information
