การเสริมฤทธิ์ยับยั้งการเจริญเติบโตและสร้างไบโอฟิล์มของ Glochidonol จาก Glochidion acuminatum กับยาปฏิชีวนะต่อเชื้อแบคทีเรียฉวยโอกาส

บทคัดย่อ

วัตถุประสงค์และที่มา : สาร Glochidonol จากตาเสือ (Glochidion acuminatum) มีสรรพคุณ แก้ปวด ลดไข้ และขับปัสสาวะ และมีฤทธิ์ทางชีวภาพต่าง ๆ มากมาย เช่น ฤทธิ์ต้านอาการอักเสบ ฤทธิ์ต้านแบคทีเรีย ต้านอนุมูลอิสระ ต้านมะเร็ง เนื่องจากเชื้อแบคทีเรียฉวยโอกาสที่พบได้บ่อยในโรงพยาบาลมีอุบัติการณ์การดื้อยาสูง ได้แก่ Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii,  Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae และ Staphylococcus aureus  โดยเฉพาะในผู้ป่วยที่มีภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่อง การติดเชื้อจากแบคทีเรียกลุ่มนี้มักมีความรุนแรงและมีแนวโน้มพัฒนาเป็นการติดเชื้อในกระแสเลือด (septicemia) ซึ่งอาจนำไปสู่ภาวะแทรกซ้อนร้ายแรงหรือเสียชีวิต ทำให้การใช้ยาปฏิชีวนะกลุ่มเตราซัยคลิน (tetracyclines) เช่น Oxytetracycline และกลุ่มเพนนิซิลลิน เช่น Ampicillin มีประสิทธิภาพลดลงและใช้ไม่ได้ผล เนื่องจากเชื้อแบคทีเรียฉวยโอกาสมีการพัฒนากลไกการดื้อยาหลายรูปแบบ เช่น การผลิตเอนไซม์ย่อยยา การลดการซึมผ่านของยา และที่สำคัญคือการสร้างไบโอฟิล์ม คือ โครงสร้างเชิงซ้อนของชั้นเมทริกซ์ชีวภาพ (extracellular polymeric substances) ที่แบคทีเรียหลั่งออกมาเพื่อห่อหุ้มตัวเองและเซลล์ใกล้เคียงภายในกลุ่มของเชื้อแบคทีเรียทำให้เชื้ออยู่รอดในสภาวะแวดล้อมที่ไม่เหมาะสม และสามารถเกิดการยึดเกาะแน่นบนพื้นผิวสัมผัส เช่น แผล อุปกรณ์ทางการแพทย์ จึงเป็นปัจจัยสำคัญที่เร่งทำให้เกิดอุบัติการณ์การดื้อยาของแบคทีเรียฉวยโอกาสสูงมาก เนื่องจากยาปฏิชีวนะต้นอนุพันธ์ เช่น ออกซี่เตตราซัยคลิน และ   แอมพิซิลลิน มีประสิทธิภาพลดลงจากกลไกการดื้อยาของแบคทีเรียดังกล่าว การพัฒนาการรักษาแบบใหม่จึงมีความจำเป็นอย่างเร่งด่วน หนึ่งในแนวทางที่มีความเป็นไปได้สูง คือการผสมผสานสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากธรรมชาติเข้ากับยาปฏิชีวนะที่มีอยู่เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการต้านแบคทีเรีย สารบริสุทธิ์ธรรมชาติคือ Glochidonol เป็นที่น่าสนใจเป็นพิเศษ เนื่องจากอาจช่วยยับยั้งการสร้างไบโอฟิล์ม เพิ่มการซึมผ่านของเยื่อหุ้มเซลล์แบคทีเรีย หรือยับยั้งเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการดื้อยาซึ่งส่งผลให้ฤทธิ์ของยาปฏิชีวนะแบบดั้งเดิมมีประสิทธิภาพมากขึ้น ดังนั้นการใช้ Glochidonol ร่วมกับยาปฏิชีวนะอาจจะเป็นทางเลือกใหม่และเป็นการศึกษาครั้งแรกของสารนี้ เพื่อแก้ปัญหาเชื้อแบคทีเรียดื้อยา และลดการปนเปื้อนของเชื้อแบคทีเรียดื้อยาในสิ่งแวดล้อมได้อย่างยั่งยืน งานวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาการเสริมฤทธิ์การยับยั้งการเจริญและสร้างไบโอฟิล์มของ Glochidonol ที่แยกได้จากตาเสือ (Glochidion acuminatum) ต่อเชื้อแบคทีเรียฉวยโอกาส

วิธีดำเนินการวิจัย : งานวิจัยนี้ศึกษาประสิทธิภาพของสาร Glochidonol ในการยับยั้งการเจริญของเชื้อแบคทีเรียฉวยโอกาส โดยการหาค่า Minimal Inhibitory Concentration (MIC) ด้วยวิธี Broth microdilution assay โดยเติม Glochidonol ที่ความเข้มข้นต่าง ๆ ในอาหาร Mueller Hinton Broth และผสมกับเชื้อแบคทีเรีย 1 × 10^⁸ CFU/ml  จากนั้นบ่มที่ 37°C นาน 18–24 ชั่วโมง และวัดค่าการดูดกลืนแสง 600 นาโนเมตร  เพื่อหาค่า MIC และหาค่าการเสริมฤทธิ์ยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียด้วยค่า Fractional Inhibitory Concentration Index (FICI) ด้วยวิธี Checkerboard microdilution assay โดยผสม Glochidonol กับยาปฏิชีวนะ จากนั้นนำสารที่ผสมแล้วมาใส่เชื้อแบคทีเรีย 1 × 10^⁸ CFU/ml และบ่มตามวิธี MIC แล้วคำนวณค่า FICI เพื่อวิเคราะห์การเสริมฤทธิ์ ส่วนการยับยั้งการสร้างไบโอฟิล์มของเชื้อแบคทีเรีย ทดสอบด้วยวิธีการย้อมสีคริสตัลไวโอเลต (Crystal Violet Assay) โดยเติมสาร Glochidonol หรือยาปฏิชีวนะ จากนั้นบ่ม 24 ชั่วโมง แล้วล้างแบคทีเรียส่วนเกินด้วย Phosphate Buffered Saline จากนั้นย้อมสีไบโอฟิล์มด้วยคริสตัลไวโอเลต 0.1% ตรึงด้วยเมทานอล 100% แล้วละลายตะกอนแบคทีเรียด้วยกรดอะซิติก 33% แล้ววัดการดูดกลืนแสง 600 นาโนเมตร 

ผลการวิจัย : พบว่าสารบริสุทธิ์ Glochidonol (GE-12) สามารถยับยั้งเชื้อแบคทีเรียฉวยโอกาสได้ทั้งในกลุ่มแบคทีเรียแกรมบวก และกลุ่มแบคทีเรียแกรมลบ GE-12 โดยแสดงฤทธิ์ยับยั้งแบคทีเรียแกรมลบได้ดีที่สุด โดยในกลุ่มเชื้อแบคทีเรียแกรมลบ GE-12 สามารถยับยั้งเชื้อ Acinetobacter baumannii และ Klebsiella pneumoniae มีค่า MIC เท่ากับ 128 ไมโครโมลาร์และเมื่อเปรียบเทียบกับยาปฏิชีวนะทั้งสองชนิดพบว่า GE-12 มีประสิทธิภาพใกล้เคียงกับแอมพิซิลลินและออกซี่เตตราซัยคลิน   โดยเฉพาะอย่างยิ่ง GE-12 แสดงการเสริมฤทธิ์กับยาออกซี่เตตราซัยคลินต่อเชื้อ Escherichia coli โดยมีค่า FICI เท่ากับ 0.56  และให้ผลการต้านฤทธิ์กับเชื้อ P. aeruginosa (FICI เท่ากับ 32) แต่ไม่ให้ผลการทดสอบกับเชื้อ  A. baumannii  การศึกษา time kill assay พบว่า สาร GE-12 สามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อ E. coli ได้ดีที่สุดในชั่วโมงที่ 8 เมื่อใช้ ความเข้มข้นสาร GE-12 (1/64 MIC) 16 µM และความเข้มข้นยาออกซี่เตตราซัยคลิน (1/8MIC) 256 µM และยับยั้งเชื้อ Pseudomonas aeruginosa ได้ดีที่สุด เมื่อใช้ความเข้มข้นสารบริสุทธิ์ GE-12 (1/32MIC) 16 µM และความเข้มข้นยาออกซี่เตตราซัยคลิน (1xMIC) 2048 µM นอกจากนี้พบว่า GE-12 ความเข้มข้น 2048   µM  สามารถยับยั้งการสร้างไบโอฟิล์มของ A. baumannii, E. coli และ P. aeruginosa ได้ดีที่สุดในช่วงเวลา 2-24 ชั่วโมง โดยประสิทธิภาพการยับยั้งอยู่ในช่วง 25-68%

สรุปผลการวิจัย  : Glochidonol ที่แยกได้จาก G. acuminatum สามารถยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียแกรมลบได้ดีกว่าแบคทีเรียแกรมบวก และสามารถเสริมฤทธิ์ยับยั้งการเจริญ และยับยั้งการสร้างไบโอฟิล์มของเชื้อแบคทีเรียดื้อยาและไม่ดื้อยาบางสายพันธุ์ ได้แก่ E. coli และ P. aeruginosa