การวิเคราะห์ฟอสโฟลิปิดที่เป็นองค์ประกอบในเลซิตินจากถั่วเหลือง ด้วยเทคนิคฟอสฟอรัสนิวเคลียร์แมกเนติกเรโซแนนซ์สเปกโตรสโคปี

บทคัดย่อ

วัตถุประสงค์และที่มา : เลซิตินจากถั่วเหลืองนิยมใช้ทั้งในผลิตภัณฑ์เสริมอาหาร และเป็นส่วนผสมในอาหาร ยา เครื่องสำอาง และอาหารสัตว์ โดยเลซิตินประกอบด้วยสารสำคัญหลายชนิด เช่น phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylinositol (PI), phosphatidic acid (PA) และ phosphatidylserine (PS) ซึ่งมีบทบาทสำคัญต่อการเจริญเติบโตของเซลล์ การขนส่งไขมัน และการสังเคราะห์สารสื่อประสาท เช่น อะเซทิลโคลีน แม้เลซิตินจะมีประโยชน์หลากหลาย แต่การบริโภคในปริมาณมากเกินไปอาจก่อให้เกิดผลข้างเคียง เช่น คลื่นไส้ อาเจียน เบื่ออาหาร หรือเหงื่อออกมาก ดังนั้นจึงมีความจำเป็นในการควบคุมคุณภาพด้วยการวิเคราะห์ชนิดและปริมาณของฟอสโฟลิด ในผลิตภัณฑ์เลซิตินอย่างถูกต้องและแม่นยำ เทคนิคที่นิยมใช้ในปัจจุบันในการวิเคราะห์ฟอสโฟลิปิด ได้แก่ โครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง (HPLC) และอินฟราเรดสเปกโทรสโคปี (FT-IR) ซึ่งสามารถวิเคราะห์ได้ทั้งเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณ อย่างไรก็ตาม เทคนิคดังกล่าวมีข้อจำกัด เช่น การพึ่งพาสารมาตรฐานอ้างอิงตามชนิดของสารที่ต้องการวิเคราะห์ อาศัยวัฏภาคคงที่และเคลื่อนที่ที่เฉพาะเจาะจง ใช้เวลาในการวิเคราะห์นาน และก่อให้เกิดของเสียจำนวนมาก ด้วยเหตุนี้งานวิจัยนี้ จึงมีความสนใจในการประยุกต์ใช้เทคนิคฟอสฟอรัสนิวเคลียร์แมกเนติกเรโซแนนซ์สเปกโทรสโคปี (³¹P-NMR) ในการวิเคราะห์ฟอสโฟลิปิด โดยเทคนิคนี้สามารถตรวจวัดฟอสโฟลิปิดหลายชนิดได้พร้อมกันในการวิเคราะห์ครั้งเดียว มีความจำเพาะสูงจากลักษณะเฉพาะของสัญญาณ ³¹P ที่แตกต่างกันในแต่ละฟอสโฟลิปิด ดังนั้นการพัฒนาและประยุกต์ใช้เทคนิค ³¹P-NMR ในการตรวจวัดชนิดและปริมาณฟอสโฟลิปิดในเลซิตินจึงเป็นทางเลือกที่มีศักยภาพสูง เพื่อลดข้อจำกัดของวิธีดั้งเดิม และเพื่อประโยชน์ต่อผู้บริโภคในด้านความปลอดภัยและคุณภาพของผลิตภัณฑ์

วิธีดำเนินการวิจัย : ในงานวิจัยนี้มีการเตรียมสารละลายสำหรับใช้ในการสกัดฟอสโฟลิปิดจากเลซิตินของถั่วเหลืองโดยใช้สารละลาย Cs₂CO₃/EDTA ความเข้มข้น 0.75 M ที่ pH 8.5 กับ deuterated chloroform และสารละลายมาตรฐาน triphenyl phosphate เข้มข้น 6 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ในตัวทำละลายเมทานอล ในอัตราส่วน 2:2:2 จากนั้นทำการสกัดตัวอย่างเลซิตินปริมาณ 300 มิลลิกรัม ที่อุณหภูมิห้องแล้วนำส่วนชั้นสารอินทรีย์ไปทดสอบด้วยเทคนิค ³¹P-NMR จำนวน 3 ซ้ำต่อตัวอย่าง ตัวอย่างเลซิตินจากถั่วเหลืองที่ทำการศึกษาแบ่งออกเป็น 4 กลุ่มตัวอย่างคือ สารมาตรฐานเลซิตินจากถั่วเหลือง เลซิตินจากถั่วเหลืองชนิดแคปซูลที่จำหน่ายตามท้องตลาด เลซิตินจากถั่วเหลืองที่ผ่านการปรับปรุงคุณภาพทางเคมี และเลซิตินที่ผู้วิจัย    ทำการสกัดจากเมล็ดถั่วเหลืองกะเทาะเปลือก มีการศึกษาค่าการวิเคราะห์คือค่าขีดจำกัดการตรวจัด (LOD) และค่าขีดจำกัดการตรวจวัดเชิงปริมาณ (LOQ) โดยใช้ตัวอย่างที่เตรียมในลักษณะเดียวกับการวิเคราะห์ปกติ เพื่อให้ได้ผลการวิเคราะห์ที่น่าเชื่อถือมีการวิเคราะห์ฟอสโฟลิปิดด้วยเทคนิค HPLC โดยเตรียมสารมาตรฐาน phosphatidylcholine (PC) ความเข้มข้น 5 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร แล้วนำมาสร้างกราฟมาตรฐานในช่วง 100–1250 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ตัวอย่างเลซิตินถูกเตรียมโดยชั่งน้ำหนัก ละลายในเมทานอล ช่วยละลายด้วยอัลตร้าโซนิก และวิเคราะห์ด้วยระบบ reverse phase-HPLC โดยใช้ตัวทำละลายเคลื่อนที่ผสมระหว่างไอโซโพรพานอล น้ำ และเมทานอล อัตราส่วน 70:22:8 ตรวจวัดที่ความยาวคลื่น 205 นาโนเมตร เป็นเวลา 30 นาที

ผลการวิจัย : การศึกษาพัฒนาวิธีการตรวจวัดชนิดและปริมาณฟอสโฟลิปิดที่เป็นองค์ประกอบในเลซิตินจากถั่วเหลืองในงานวิจัยนี้ได้ทำการศึกษาวิธีการวิเคราะห์ในกลุ่มตัวอย่าง 4 ประเภทคือสารมาตรฐานเลซิตินจากถั่วเหลือง เลซิตินที่สกัดจากเมล็ดถั่วเหลืองกะเทาะเปลือก เลซิตินจากถั่วเหลืองชนิดแคปซูล และเลซิตินจากถั่วเหลืองที่ทำการปรับเปลี่ยนโครงสร้างทางเคมี ผลการวิเคราะห์พบว่าในตัวอย่างเลซิตินจากถั่วเหลืองที่ทำการศึกษาทั้งหมดพบฟอสโฟลิปิดที่เป็นองค์ประกอบ ทั้งสิ้น 11 ชนิดคือ phosphatidylcholine (PC), 1-lysophosphatidylcholine (1-LPC), phosphatidylinositol (PI), 2-lysophosphatidylcholine (2-LPC), lysophosphatidylinositol (LPI), phosphatidylethanolamine (PE), diphosphatidyl glycerol (DPG), lysophosphatidylethanolamine (LPE), phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylserine (PS) และlysophosphatidic acid (LPA) โดยมีชนิดและปริมาณที่แตกต่างกันแบ่งออกเป็นแต่ละกลุ่มคือ สารมาตรฐานเลซิตินจากถั่วเหลืองพบฟอสโฟลิปิดทั้งสิ้น 10 ชนิด เลซิตินที่สกัดจากเมล็ดถั่วเหลืองกะเทาะเปลือกพบฟอสโฟลิปิดทั้งสิ้น 7 ชนิด เลซิตินชนิดแคปซูลที่จำหน่ายในรูปแบบอาหารเสริมพบฟอสโฟลิปิดทั้งสิ้น 11 ชนิด และเลซิตินที่ผ่านกระบวนการปรับปรุงทางเคมีพบฟอสโฟลิปิดทั้งสิ้น 11 ชนิด ซึ่งฟอสโฟลิปิดแต่ละชนิดปรากฏสัญญาณ ³¹P-NMR ที่ค่า chemical shift แตกต่างกันอย่างชัดเจนในช่วง -0.77 ถึง 3.8 ppm เมื่อศึกษาค่า relaxation time (T₁) พบว่าฟอสโฟลิปิดที่เป็นองค์ประกอบในเลซิตินจากถั่วเหลืองจะมีค่า T₁ ของอะตอมฟอสฟอรัสอยู่ในค่าไม่เกิน 2 วินาที ในขณะที่สารมาตรฐานอ้างอิง triphenyl phosphate ทีใช้เป็นสารอ้างอิงในการคำนวนหาปริมาณฟอสโฟลิปิด พบว่าให้ค่า T₁ อยู่ที่ 5.65 วินาที ซึ่งเป็นค่าที่สูงที่สุดครอบคลุม T₁ ของฟอสโฟลิปิดชนิดอื่นๆ และกำหนดให้ค่า number of scan มีค่าเท่ากับ 256 ซึ่งจะได้ค่า signal to noise ratio เท่ากับ 3070 ซึ่งจะใช้เวลาทดสอบหาปริมาณฟอสโฟลิปิดต่อหนึ่งตัวอย่างที่ประมาณ 46 นาที สำหรับค่าทางการวิเคราะห์คือขีดจำกัดการตรวจวัด (LOD) และขีดจำกัดการตรวจวัดเชิงปริมาณ (LOQ) ด้วยเทคนิค ³¹P-NMR มีค่าเท่ากับ 0.01 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร และ 0.02 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตรตามลำดับ

สรุปผลการวิจัย : งานวิจัยนี้มีประสบความสำเร็จในการพัฒนาและประเมินประสิทธิภาพของเทคนิค ³¹P-NMR สำหรับการวิเคราะห์ชนิดและปริมาณของฟอสโฟลิพิดที่เป็นองค์ประกอบในเลซิตินจากถั่วเหลือง โดยมุ่งลดข้อจำกัดของวิธีวิเคราะห์แบบดั้งเดิม อาทิเช่น HPLC, TLC และ FTIR ซึ่งมีข้อจำกัดด้านความต้องการใช้สารมาตรฐานเฉพาะชนิด ใช้ระยะเวลาในการวิเคราะห์นาน และก่อให้เกิดของเสียในปริมาณมาก ผลการวิเคราะห์แสดงให้เห็นว่าตำแหน่งสัญญาณ (chemical shift) ของฟอสโฟลิปิดแต่ละชนิดจากกลุ่มตัวอย่าง 4 ประเภท มีความเหมือนกันและแยกออกจากกันอย่างชัดเจนในช่วง -0.77 ถึง 3.80 ppm เหมาะสมที่จะนำมาวิเคราะห์เชิงคุณภาพและปริมาณ อันเนื่องมาจากความแตกต่างของโครงสร้างเคมีของฟอสโฟลิปิดดังกล่าว ผลการศึกษายังแสดงให้เห็นว่าการวิเคราะห์ด้วยเทคนิค ³¹P-NMR สามารถวิเคราะห์ชนิดและปริมาณฟอสโฟลิปิดจากถั่วเหลืองได้ถึง 11 ชนิดในการทดสอบเพียงครั้งเดียวและใช้เวลาทดสอบเพียง 46 นาที ส่งผลให้สามารลดเวลา ของเสียที่เกิดขึ้น และไม่ต้องพึ่งพาสารมาตรฐานตามชนิดของฟอสโฟลิปิดที่ต้องการวิเคราะห์ และที่สำคัญให้ค่าขีดจำกัดการตรวจวัดต่ำถึง 0.01 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร